При изучении вопросов посвященных диагностике болезней животных следует обратить особое внимание на то, что предварительный диагноз ставя на основании клинико-эпизоотических данных результатов патологоанатомического вскрытия, а окончательный – с учетом результатов лабораторных исследований. Учтите, чтовирусные инфекции имеют тенденцию к быстрому распространения, массовости, тяжелому течению болезни. Поэтому диагноз должен быть поставлен как можно быстрее и точно. Ведущая роль при этом принадлежит методам лабораторной диагностики, так как многие болезни, обусловленные ими, имеют сходные эпизоотологические данные, клинические симптомы и патологоанатомические изменения. Кроме того, они часто носят смешанный характер (микст-инфекции), проявляются в атипичных и латентных формах течения.

Важная роль принадлежит при этом быстрой и правильной транспортировке патологического материала, так как существует возможность инактивации вируса при воздействии положительных температур и других факторов. Материал для лабораторного исследования может быть отобран как при жизни животного, так и посмертно.

 Опишите отбор биоматериала на примере какой-либо произвольно выбранной вирусной болезни.

 Обратите внимание на то, что лабораторная диагностика складывается из трех методических приемов (направлений):

1.                на быстром обнаружении возбудителя (его антигенов) или специфических изменений (телец-включений и других специфических для вируса патоморфологических изменений и т.д.) в патологическом материале (экспресс- диагностика, можно получить ответ через несколько часов);

2.                использовании вирусологических методов, которые основаны на изоляции активной формы вируса из патологического материала и его идентификации в серологических реакциях. Методы отличаются длительными и трудоемкими исследованиями, но дают точный ответ о возбудителе болезни. В ряде случаев вирус можно идентифицировать без выделения активных форм, используя современные методы диагностики (полимеразно – цепную реакцию, иммуноферментный или иммунофлюоресцентный методы и др.)

3.                использовании методов ретроспективной диагностики, которые основаны на установлении титра антител в парных пробах сыворотки больных животных.

Дают высокодостоверные результаты, но ретроспективно (с опозданием).  

Обратите внимание на то, что некоторые серологические реакции (реакции, основанные на взаимодействии антиген + антитело) могут быть использованы как для экспресс-  или ретроспективной диагностики, так и для идентификации вируса. Экспресс - методы:

–– различные виды микроскопии (световая, люминесцентная, электронная; –– реакция гемагглютинации (РГА);

–– серологические реакции (реакция связывания комплемента (РСК); реакция торможения (задержки) гемагглютинации (РТГА); (РЗГА), реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), реакция диффузной преципитации (РДПА), реакция нейтрализации (РН), иммунофлюоресценции (РИФ), иммуноферментной анализ (ИФА);

–– полимеразно-цепная реакция (ПЦР) и др.

Выделение вирусов проводят на лабораторных животных, клеточных культурах, куриных эмбрионах, а идентификацию-в серологических реакциях, указанных выше. Одной из наиболее точных серологических реакций является реакция нейтрализации. Однако она обладает существенным недостатком - длительность получения результата.

Стоит отметить, что в настоящее время всё большую популярность приобретают современные экспресс-методы диагностики.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – это методы выявления антигена с помощью антител, коньюгированных с флюорохромом. Метод делится на прямой (меченая сыворотка взаимодействует непосредственно с антигеном) и не прямой (используется меченая антиглобулиновая сыворотка для выявления иммунного комплекса). Идентификация результатов реакции проводится путём люминесцентной микроскопии.

Иммуноферментный анализ (ИФА) – отличие этого метода от предыдущего заключается в том, что антитела метятся специальным ферментом. Существует два способа постановки реакции: гистохимический (для выявления антигена) и непрямого твердофазного ИФА (для выявления антител в сыворотке). Для визуализации результатов реакции используется специальный субстрат изменяющий окраску под воздействием фермента

Самостоятельно изучите методику и особенности проведения различных серологических реакций, оцените их значение в диагностике инфекционных заболеваний животных.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) – основана на трёхэтапном циклическом процессе, в результате которого многократно увеличивается количество специфического фрагмента ДНК. Каждый цикл состоит из последовательных стадий: денатурации, отжига (гибридизации) праймеров, полимеризации или элонгации (удлинения) цепи ДНК. При денатурации (94-95C) происходит разделение («расплавление») двуцепочечной ДНК в одноцепочечную (ДНК переходит в однонитевую форму). При понижении температуры до 50-60C («температуры отжига») праймеры (специфические одноцепочечные участки ДНК синтезирующиеся химически для ограничения исследуемого участка) гибридизуются с комплементарным им участком матрицы (исходной ДНК). При повышении температуры до 72C создаются условия для работы ДНК-полимеразы, с помощью которой синтезируется выбранный участок ДНК. Данный процесс повторяется многократно в результате чего увеличивается количество фрагментов ДНК. 

Для оценки результатов реакции используют электрофорез либо проводят реакцию с мечеными праймерами для последующей оценке изменения цвета после добавления субстрата, либо флуориметрии. Так же результаты ПЦР можно контролировать колориметрированием. Широкое распространение получил метод, основанный на молекулярной гибридизации с применением модифицированных праймеров.

В настоящее время существует несколько разновидностей ПЦР: Метод ОТ-ПЦР (модификация метода для обнаружения РНК с применением обратной транскриптазы); «гнездовая» ПЦР (nested)–обеспечивает копирование только специфических участков ДНК, что повышает чувствительность анализа; ПЦР «с горячим стартом» (hotstart) – ведёт к повышению выхода готового продукта; ПЦР с плавным снижением температуры отжига (touchdown)– значительно увеличивает выход готового продукта реакции; градиентная ПЦР (gradient) – модификация предыдущей реакции с созданием линейного градиента температуры отжига; протяжённая ПЦР (long) – применяют для амплификации протяжённых участков ДНК; ПЦР в ткани или клетке (insitu) – при исследовании внутриклеточных процессов размножения и развития вирусов; ПЦР от одной клетки (single-cell) применяется при генетических экспериментах и перинатальной диагностике. 

Одним из самых современных вариантов ПЦР является ПЦР-РВ (в реальном времени). Она основана на количественной детекции флуоресцентного сигнала, который увеличивается пропорционально количеству ПЦР-продукта. В качестве красителя используют химические агенты неспецифически связывающиеся с ДНК либо флуоресцентные зонды.Следовательно, результат можно регистрировать в процессе реакции, в каждый момент времени. Уясните суть реакции и отличия её модификаций.

Ретроспективная диагностика базируется на использовании серологических реакций, положительным результатом при которых является увеличение или уменьшение титра антител не менее чем в 4 раза (2 log2) в сыворотках животных, взятых с интервалом 14-21 день.

Эти реакции различаются между собой методом определения образования комплекса антиген + антитело и техникой постановки.

 При описании реакций (диагностических приемов) укажите на принцип (сущность), достоинства и недостатки, для каких целей чаще всего их используют. Подробно опишите технику постановки одной из них на примере произвольно выбранной вирусной болезни животных. 


Последнее изменение: четверг, 26 марта 2020, 15:01